氨基酸的高效液相色譜方法分析
氨基酸的高效液相色譜分析方法主要分為間接分析和直接分析兩種。
間接分析分為柱前衍生法和柱后衍生法；直接分析法包括高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法和高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法。
現(xiàn)在，菲羅門(mén)公司的Comix 色譜柱可使用簡(jiǎn)單流動(dòng)相在HPLC中檢測(cè)非衍生氨基酸。
柱前柱后衍生法的優(yōu)缺點(diǎn)：
柱前衍生法具有衍生試劑種類(lèi)多、衍生時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但衍生副產(chǎn)物以及衍生物水解會(huì)造成干擾。
柱后衍生法具有反應(yīng)重復(fù)性好、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)靈敏度較低、反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、通常需要特定的設(shè)備配件，儀器價(jià)格高等，由于衍生反應(yīng)在特定反應(yīng)器中進(jìn)行，常造成色譜峰展寬，使分離度降低。
直接檢測(cè)法及優(yōu)缺點(diǎn)：
HPLC －ELSD 法：該方法的缺點(diǎn)是靈敏度較低，不能很好地解決痕量氨基酸的檢測(cè)難題，且在檢測(cè)時(shí)，響應(yīng)值常與被測(cè)物濃度不呈線(xiàn)性關(guān)系或線(xiàn)性響應(yīng)范圍較窄，不利于定量分析。
HPAEC －IPAD 法：積分脈沖安培檢測(cè)法無(wú)需衍生處理，只需將樣品稀釋至適當(dāng)濃度即可直接進(jìn)行分離檢測(cè)。但此類(lèi)氨基酸分析儀器專(zhuān)屬性強(qiáng)，價(jià)格昂貴。
使用Comix 色譜柱在HPLC上檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、能夠直接分離以及無(wú)需衍生等特點(diǎn)。且無(wú)需特定設(shè)備儀器，在HPLC上使用Comix 色譜柱可以直接進(jìn)行分離檢測(cè)。
下面我們來(lái)簡(jiǎn)單介紹一下Comix 色譜柱。
反相色譜柱是最常用色譜分析方法，但是存在極性很大的化合物很難保留、早出的峰往往變形、對(duì)極性差別很大的混合物很難使用等度分析方法等問(wèn)題。
FLM公司為克服上述問(wèn)題，更好的解決以及服務(wù)客戶(hù)，經(jīng)多年研發(fā)并推出新型Comix系列色譜產(chǎn)品。先進(jìn)的Comix系列硅膠色譜柱包含有疏水的碳長(zhǎng)鏈可以提供疏水作用，同時(shí)鑲嵌陽(yáng)離子，陰離子或是陰陽(yáng)離子的基團(tuán)，提供穩(wěn)定的離子作用。也就是說(shuō)這種色譜柱同時(shí)提供了疏水和離子以及極性作用。可以解決傳統(tǒng)反相色譜柱可能難以解決的問(wèn)題。
Comix系列硅膠色譜柱的特色固定相有以下七種。
? Comixshell CARP 與 Comixsil RP-CX
表面陰離子嵌入鍵合，提供穩(wěn)定的陽(yáng)離子交換作用，疏水作用
? Comixshell AIRP 與 Comixsil RP-AX
表面陽(yáng)離子嵌入鍵合，提供穩(wěn)定的陰離子交換作用，疏水作用
? Comixsil ACRP與Comixsil RPAC
陰陽(yáng)兩種離子同時(shí)嵌入烷基鍵合硅膠，提供穩(wěn)定的陰離子與陽(yáng)離子交換作用，疏水作用，Hilic作用
? Comixsil HCS
表面陰離子嵌入鍵合，提供穩(wěn)定的陽(yáng)離子交換作用
表面長(zhǎng)碳鏈，提供穩(wěn)定的疏水作用
表面特殊的氫鍵授于與接受
同時(shí)提供的離子排阻作用
適用于所有有機(jī)溶劑與純水相
兩個(gè)應(yīng)用案例（更多請(qǐng)?jiān)斣?xún)菲羅門(mén)公司銷(xiāo)售）：
Comixshell CARP 色譜柱對(duì)12種非衍生氨基酸的HPLC分離（沒(méi)有離子對(duì)試劑）
色譜柱: Comixshell CARP
色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm (FMF-CARP-EONU)
流動(dòng)相:
|
時(shí)間（min） |
乙腈（mL） |
水（mL） |
硫酸（mL） |
|
0 |
20 |
979.8 |
0.2 |
|
15 |
500 |
498 |
2 |
流速: 1 mL/min
檢測(cè): UV 220 nm
Comixsil HCS柱分析18種非衍生氨基酸（可匹配MS)
色譜柱：Comixsil HCS 3μm 100×3.0mm
（貨號(hào)：FMD-HCS3-YONU）
流動(dòng)相：乙腈：100mM 甲酸銨（pH 3）=80:20
流速：0.6mL/min
進(jìn)樣體積：3μL
樣品濃度：0.6mg/mL
檢測(cè)器：ELSD 45oC
1.Tryptophan （色氨酸）
2.Phenylalanine （苯丙氨酸）
3.Leucine （亮氨酸）
4.Methionine （蛋氨酸）
5.Tyrosine （酪氨酸）
6.Isoleucine （異亮氨酸）
7.DOPA （二羥基苯丙氨酸）
8.Valine （纈氨酸）
9.Cysteine （半胱氨酸）
10.Proline （脯氨酸）
11.Alanine （丙氨酸）
12.Threonine （蘇氨酸）
13.Glutamic acid （谷氨酸）
14.Glycine （甘氨酸）
15.Glutamine （谷氨酰胺）
16.Asparagine （天冬酰胺）
17.Serine （絲氨酸）
18.Aspartic acid （天冬氨酸）
最后，對(duì)于研究手性氨基酸的工作者，我公司的18種液相手性柱，擁有幾乎對(duì)所有的FMOC, BOC保護(hù)型氨基酸的手性拆分應(yīng)用。歡迎有需要的分析工作者咨詢(xún)。
附錄：
資料來(lái)源：
［1］赫欣睿. 高效液相色譜法測(cè)定氨基酸的研究進(jìn)展［J］，分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2016(7)：922-928.
［2］唐濤. 氨基酸柱前衍生化HPLC方法發(fā)展及應(yīng)用［J］，南京理工大學(xué)，2006.
