HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南：稀釋作用

對于配制包含緩沖液和有機溶劑的流動相，有幾種方式可選。

對于等度工作，流動相可以手動混合，通過泵將其從單個容器中取用。

或者，使用HPLC系統混合組分。

濃縮的緩沖液可與純有機溶劑混合，或者將稀釋的緩沖液與含有相同濃度緩沖液的有機溶劑混合。

如果采用梯度洗脫法，只能使用最后兩種技術（在等度或梯度系統中，A和/或B溶劑可以是水/有機混合物）。

每種混合技術各有利弊。由于手動混合法可以觀察混合物的澄清度，并且能在使用前進行過濾，以去除沉淀，因此使HPLC系統出現緩沖液沉淀的可能性最小。
在線式混合方便等度方法的開發，并且也是梯度洗脫所必需的。

水狀緩沖液與純有機溶劑的混合十分簡單，但存在兩個潛在問題。首先，由于緩沖液被有機溶劑所稀釋，所以A-溶劑的緩沖液濃度必須高于流動相所需的緩沖液濃度；其次，會存在緩沖液濃度反向梯度的情況。在緩沖液和有機溶劑最初于混合器中接觸時，緩沖液濃度越高，越有可能產生沉淀。

在前述例子中，含有10mM磷酸鉀且pH為7.0的60%的ACN可溶于本體溶液中，但A容器將需要25mM磷酸鹽。當25mM磷酸鹽在混合器中接觸100％的ACN時，可能會產生沉淀。

混合上述溶劑的另一種方法是：將10mM的磷酸鹽放入A容器中。對于B-溶劑，手動混合70％的ACN和30％的含有33mM磷酸鹽的緩沖液，從而制備含有10mM磷酸鹽的70％ACN（表3臨界濃度的一半）。現在可以混合
A-和B-溶劑，從而獲得60％ACN，其最終濃度將含有10mM的磷酸鹽。

該技術可有效避免HPLC內部出現緩沖液沉淀的情況，并且可利用在線式混合方法，任意混合70％或更少ACN的流動相。

同時，緩沖液的濃度在整個梯度內恒定，所以在梯度過程中無需考慮緩沖液的稀釋，使梯度洗脫更具優勢。